La technique de polymérisation en chaîne (en anglais « polymerase chain reaction ») ou PCR, permet d’amplifier des millions de fois un unique fragment d’ADN. Cette méthode est devenue un outil précieux non seulement pour la recherche en biologie moléculaire mais également pour le diagnostique médical, la détermination de microorganismes ou encore la criminologie. L’invention de la PCR revient à Kary Mullis dans les années 80. Il obtint pour cette découverte le Prix Nobel de Chimie en 1993. La découverte d’ADN polymérases thermorésistantes (la Taq polymérase par exemple) isolées de bactéries (Thermus aquaticus) vivant dans des sources d’eau chaude a facilité l’utilisation de la PCR et a permis son automatisation.

Thèmes : la PCR, la structure du génome humain, le génotypage, la criminologie, l’ADN, l’électrophorèse.

La PCR : Une réaction de PCR nécessite :

1. de l’ADN à amplifier (dénommé template)
2. des amorces (également appelés primers)
3. des desoxynucléotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
4. une  ADN polymérase thermorésistante (la Taq par exemple)
5. du magnésium (Mg++) indispensable au fonctionnement de l’ADN polymérase

Ces 5 ingrédients sont mélangés dans un tube à essai et soumis à différents cycles de températures.

1ère étape : la dénaturation (94°C). L’ADN template est chauffé à 94°C. Les deux brins de l’ADN se séparent. On parle de dénaturation de l’ADN. 2ème étape : l’hybridation (40-65°C). En descendant la température, les amorces s’apparient (s’hybrident) par complémentarité à leurs séquences cibles sur l’ADN. 3ème étape : l’élongation (72°C). A cette température, la Taq synthétise les brins d’ADN complémentaires en ajoutant des desoxynucléotides triphosphates à la suite des amorces. Le temps d’élongation dépend de la taille du fragment à amplifier et de la vitesse de polymérisation de l’enzyme (la Taq ajoute environ 1000 nucléotides par minute).

Ces trois étapes correspondent à 1 cycle de PCR, à la suite duquel on a doublé le nombre de fragment d’ADN cible initial. Environ une trentaine de cycle sont en principe effectués dans une expérience de PCR classique. Ainsi, après 30 cycles on aura amplifié 2n fois notre ADN cible.

Un schéma de l'amplification par PCR est visible ici:

Les séquences alu :
L’ADN humain est constitué  de nombreuses séquences répétées représentant plus de 50% du génome. Les séquences Alu font partie des éléments répétés les plus abondants. Il s’agit de courtes séquences d’environ 300 pb qui ont été mobilisées chez les primates il y a environ 65 millions d’années. Le nom de ces séquences vient du fait qu’elles possèdent un site de restriction pour l’enzyme AluI. La dispersion des séquences Alu dans le génome s’effectue en utilisant un intermédiaire ARN par un processus dénommé rétroposition. Ces éléments Alu contribuent à l’évolution du génome, à son architecture mais peuvent également être la cause de certaines maladies génétiques. Les séquences Alu continuent de se disperser à raison d’une insertion toute les 200 naissances.
Certaines séquences Alu se sont insérées récemment (il y a environ 1 million d’année) et ne se retrouvent pas chez tous les individus. Ce polymorphisme peut être utilisé pour l’étude des populations. Par exemple, le locus PV92 situé sur le chromosome 16 peut, suivant les personnes, contenir ou non une séquence Alu. Certains individus possèdent ainsi un élément Alu sur leurs 2 chromosomes 16 (+/+), ou sur l’un des 2 (+/-), on  pas d’insertion à ce locus (-/-).

L'EXPERIENCE:

Protocole :

1) Extraction d'ADN à partir de cellules épithéliales de la bouche

• Mettre 500 µl d'H2O dans un tube Eppendorf
• Frotter abondamment l’intérieur des joues avec un écouvillon (coton tige) stérile afin d’obtenir un maximum de cellules épithéliales
• Tremper l'écouvillon dans le tube contenant les 500 µl d'H2O. Tourner l'écouvillon et le frotter contre les parois du tube
• Bien essorer l'écouvillon en le sortant du tube
• Centrifuger le tube 2 minutes à la vitesse maximum afin de faire tomber les cellules épithéliales.
• A l’aide de la P1000 enlever le surnageant en prenant soin de laisser le culot de cellules au fond du tube. Attention à ne pas aspirer le culot de cellules. Le cas échéant centrifuger à nouveau la salive.
• Ajouter 0.1 ml de solution de NaOH 200 mM sur le culot et le resuspendre en vortexant ou en pipetant à l'aide de la P1000
• Fermer le tube et incuber à 95 °C  pendant 10 minutes dans le bloc chauffant
• Vortexer brièvement
• Ajouter 0.1 ml de HCl 200 mM dans votre tube.
• Ajouter 0.1 ml Tris-HCl (pH 8.5) 200 mM dans votre tube.
• Votre préparation d’ADN est prête et peut être stockée au congélateur ou utilisée directement pour la suite de l’expérience

2) Amplification par PCR

• • Observez votre génotype et ceux des autres personnes.
  • Calculez la fréquence des génotypes  de la classe.
  • Calculez la fréquence des allèles de la classe.
  • Calculez la valeur de Hardy-Weinberg pour la classe.

Un autre exemple d'analyse de résultats est accessible ici